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疑難解析 | 2023年度直播答疑熱點(diǎn)匯總

更新時(shí)間:2024-01-16  |  點(diǎn)擊率:665


細胞培養過(guò)程中,我們通常會(huì )遇到各種各樣的問(wèn)題,這些問(wèn)題一般是多種因素造成的,如細胞密度、培養環(huán)境、操作方法等。2023年,普諾賽圍繞細胞培養問(wèn)題,共舉辦了10場(chǎng)線(xiàn)上直播,吸引了萬(wàn)余人觀(guān)看。直播期間,大家踴躍發(fā)言,提出了日常實(shí)驗中遇到的問(wèn)題。本期直播答疑篩選出部分問(wèn)題做了詳細解答。


牙源性干細胞培養時(shí),血清會(huì )誘導分化嗎?

血清成份復雜,里面包含抑制分化的因子,也包含促進(jìn)分化的因子;間充質(zhì)干細胞一類(lèi)成體干細胞大多可以用血清培養,單能干細胞,用血清不會(huì )分化;胚胎干會(huì )細胞分化。

血清的刺激分化主要與血清品質(zhì)相關(guān),品質(zhì)高的可以維持干細胞增殖,抑制分化;品質(zhì)較低的如新生牛血清會(huì )誘導分化;與生產(chǎn)批次也有關(guān)系,不同批次因子含量不一,分化效果不一。

? 篩選品質(zhì)高的血清批次;

? 添加抑制分化的因子,如bFGF,EGF等;

? 及時(shí)傳代,控制密度,刺激增殖,高密度會(huì )引起分化;

? 及時(shí)換液,防止代謝累積,刺激分化;

? 控制培養基質(zhì)量如內毒素、支原體、pH等等,控制環(huán)境穩定。

LX2細胞培養有哪些需要注意的點(diǎn)?

細胞密度高的時(shí)候,消化3~4 min 才能完-全消化下來(lái),細胞高密度下生長(cháng)速度快,低密度下細胞增殖慢甚至死亡,建議傳代比例控制在1:2~1:4,不要超過(guò)1:4。

鏡下觀(guān)察,已經(jīng)開(kāi)始生長(cháng)分化的細胞漂浮

很多是什么原因?

細胞分化了之后是不會(huì )再增殖的。細胞分化實(shí)驗前期,細胞還能緩慢增殖,但隨著(zhù)實(shí)驗的進(jìn)展,漂浮的細胞越來(lái)越多,這時(shí)候要分不同的情況處理:

? 如果實(shí)驗前,細胞長(cháng)得過(guò)滿(mǎn),可能因為接觸抑制產(chǎn)生較多漂浮細胞。這種情況下,只要貼壁的細胞沒(méi)有受到影響,實(shí)驗可以繼續;

? 另一種情況,是實(shí)驗開(kāi)始時(shí)的密度合適,實(shí)驗開(kāi)始后,貼壁的細胞慢慢脫落漂浮,這種情況是不正常的,需要結合實(shí)驗前細胞狀態(tài)、實(shí)驗所用的誘導試劑對細胞的影響等多方面的因素去調整。

NK-92細胞有些臟,怎么梯度離心呢?

正常培養的細胞系是沒(méi)有梯度離心這個(gè)概念的,梯度離心通常是用于細胞提取時(shí),多種細胞混合在一起的一種分離措施。懸浮細胞培養的過(guò)程中會(huì )始終伴隨著(zhù)細胞的死亡,細胞死亡后裂解就會(huì )產(chǎn)生碎片。這種可以通過(guò)低速離心(800 rpm,3~5 min)去除一部分,但無(wú)法完-全去除。

細胞的密度怎么判斷?

懸浮細胞需要計數來(lái)判斷。貼壁細胞可以看不同視野下細胞的密度,以大多數視野下的密度為準。需要注意的是,不是所有細胞都會(huì )平鋪單層,有些細胞可能會(huì )堆疊生長(cháng),比如Hep G2。

THP-1細胞貼壁了,是怎么回事呢?

THP-1是一類(lèi)單核細胞,可以在特定的情況下分化為M0型的巨噬細胞,這時(shí)的細胞就是會(huì )貼壁的。培養的過(guò)程中如果發(fā)現細胞出現了貼壁的情況,傳代的時(shí)候可以只收集漂浮的細胞。同時(shí)排查實(shí)驗室的環(huán)境、培養基、血清等,看看有沒(méi)有什么特定的影響因素導致細胞貼壁。

NK-92越養活力越低,怎么辦?

細胞培養傳代次數多了,會(huì )存在狀態(tài)越來(lái)越差的情況??梢栽诩毎麪顟B(tài)好的時(shí)候,一邊傳代,一邊凍存。NK-92細胞有很強的IL-2依賴(lài)性,培養時(shí)要注意避免過(guò)度吹打,團塊吹散的同時(shí),細胞也容易受損。培養過(guò)程中,一方面需要注意及時(shí)添加IL-2,一方面也需要注意吹打次數,一般輕輕吹2~3下將大團吹成小團就可以了。

貼壁細胞,會(huì )有一些亮晶晶像油一樣的東

西,這是污染了嗎?

需要結合具體的細胞及圖片具體分析。如果是一些有成脂能力的細胞,不排除是細胞培養的過(guò)程中受到某種刺激分化形成了脂滴。除此以外,還需要排除器皿本身的影響。最后結合顯微鏡下的圖片及視頻進(jìn)行判斷,看是否有明顯微生物的痕跡。如果上述方法都無(wú)法判斷,必要時(shí),可以收集細胞培養液置于37℃培養箱進(jìn)行空培養,觀(guān)察是否有明顯的微生物增殖。

為什么復蘇后細胞就老化了?

細胞復蘇后老化,可能是因為細胞凍存前的狀態(tài)不佳,以及凍存時(shí)的保存活性效果不好,這些都會(huì )影響細胞狀態(tài),其中凍存損傷影響比較常見(jiàn)。建議控制凍存前狀態(tài)、控制凍存過(guò)程及凍存液確保細胞活率。

誘導成脂肪細胞,只看形態(tài)嗎?需要其他

方法進(jìn)行鑒定嗎?

一般誘導效果好,脂滴大,相差顯微鏡白光可以觀(guān)察到油滴,可能會(huì )存在誤判,建議使用標準檢測方法,用油紅O染色方法鑒定。

懸浮細胞怎么進(jìn)行脂質(zhì)體轉染?

懸浮細胞通常是當天按實(shí)驗所需細胞量接種細胞,后續配置轉染復合物,將轉染復合物滴加到培養基中,根據摸索好的轉染時(shí)間,收樣檢測。

DNA和siRNA共轉染如何操作?

設置好分組,空白對照、陰性對照、陽(yáng)性對照、DNA、siRNA、DNA和siRNA共轉染(用無(wú)血清培養基稀釋DNA和siRN及DNA,無(wú)血清培養基稀釋轉染試劑),摸索適宜的濃度、比例、轉染時(shí)間。

懸浮細胞培養,易成團,如何盡量減少成

團?

大多數懸浮細胞培養時(shí)都會(huì )聚團,還有些懸浮細胞本身就是聚團長(cháng)的,不聚團說(shuō)明細胞活性較差,如NK-92細胞。培養本身是聚團生長(cháng)的懸浮細胞,是不可以減少細胞團的。如果是存在少數聚團,大部分單顆懸浮的細胞,可以將細胞進(jìn)行高密度培養.一般密度在200萬(wàn)/mL時(shí),細胞大部分是單顆分散的。

NCI-929細胞復蘇后很難養,細胞不增殖,

怎么辦?

這是一株對營(yíng)養要求較高的懸浮細胞,培養的時(shí)候需要添加β-巰基乙醇。如果細胞剛復蘇就生長(cháng)緩慢,可以先用臺盼藍染色檢測細胞的活性。如果是復蘇時(shí)生長(cháng)狀態(tài)較好,但傳代后生長(cháng)緩慢,可能是培養基的營(yíng)養不夠,比如沒(méi)有加β-巰基乙醇等。另外,細胞不增殖可能與接種時(shí)的密度太低有關(guān)。懸浮細胞培養是有密度要求的,一般情況下密度控制在50-200萬(wàn)/mL為佳,密度太低了,細胞增殖緩慢,密度太高了,細胞可能會(huì )慢慢裂解死亡。






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